裸甲藻溶藻细菌的筛选及其胞外抑藻活性物质的分离鉴定

【摘要】在适宜的条件下,一些藻类能够急剧增加或聚集,海水中藻细胞密度锐增,使水体颜色改变,并有可能造成海洋生物死亡,这就是所谓的赤潮(redtide)现象。除了微藻外,其他一些单细胞浮游生物也能够形成赤潮。海洋水体富营养化是导致赤潮的直接原因。国内外对赤潮的研究已持续几十年,前人在采用物理、化学和其他生物学方法治理赤潮不甚理想的状况下,利用微生物进行生物控藻引起了人们的极大关注目前,溶藻微生物主要包括：溶藻细菌、溶藻放线菌、溶藻真菌、噬藻体、原生动物。是最具潜力的生物控制方法之一。溶藻细菌(Algicidalbacteria)是指以直接或间接方式抑制或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌统称。1924年溶藻细菌首次被发现微藻中的裸甲藻,是南方海域赤潮爆发多见报道的一种优势藻种。裸甲藻属甲藻门,是单细胞微藻,是水生动物的饵料,大量繁殖使水体在阳光的照射下反映出红棕色,但过量生长则形成对水产有害的“赤潮”。而且能够产生多种毒素,使鱼虾贝类死亡等,对人体亦有危害。国内外对裸甲藻引起的赤潮研究相对较少。本研究依次从中国莱州湾、胶州湾以及海南三亚市红沙港等海域采集水样,采用液体感染法,即将划线分离的单菌落菌液与裸甲藻培养物共培养,最终从海南三亚市红沙港海域分离到两株对裸甲藻(Gymnodiniumsp.)有明显抑制效果的海洋细菌HSB01和HSB07.且细菌HSB07比HSB07抑藻效果更强。通过对两株菌的形态观察、分子和生理生化特征鉴定,得出HSB01是葡萄球菌属,HSB07是盐单胞菌属。通过发酵两株菌并分离细菌菌体与胞外代谢物,然后分别与裸甲藻共培养试验,发现HSB07用乙酸乙酯萃取的发酵物粗提物表现出相对明显的抑藻作用。对细菌HSB07进行20LLB海水培养基规模发酵,得到14g粗提物。经硅胶柱层析、薄层层析得到两个组分B和C。将适量组分B和C以DMSO(二甲基亚砜)溶解,同样采用液体感染法,即将DMSO溶解的组分B和c分别与裸甲藻培养物共培养,发现组分B具有显著的抑藻作用,组分c亦具有一定的抑藻作用。组分B和c进一步进行凝胶柱层析、液相分析与分离,从组分c分离得到一个纯组分,即为组分#12。对组分#12采用核磁共振和质谱分析鉴定,确定其分子量为414。具体结构还需进一步分析鉴定。鉴于20L规模发酵得到的生物量不够理想,因而对细菌HSB07的发酵条件进行了优化。参考20L规模发酵条件28℃、pH7.5、盐度为3、发酵时间24-48h。以发酵液的pH、盐度和发酵时间三个因素作为影响胞外活性物质含量的主要参数。各因素选取3个水平进行正交实验,选用L9(34)正交表设计实验。将发酵好的细菌发酵液高速离心(6500rpm)10min,分离得到上层细菌胞外代谢物和下层菌体,收集上层液。向120m1藻培物中加入15m1细菌胞外代谢物与藻共培养,以溶藻率作为评价发酵条件的指标。主要实验结果如下：1.裸甲藻溶藻菌的筛选、鉴定1)从海南三亚红沙岗水样中共分离出7株细菌,其中2株细菌表现出明显的抑藻作用,分别标记为HSBO1、HSB07.抑藻试验再验证并进行差异显著性检验得知：细菌HSBO1和HSB07均具有较强的抑藻作用,且细菌HSB07比HSBO1抑藻作用更强。2)对2株溶藻细菌进行分子鉴定：16SrDNA测序,与Genbank中已知序列BLAST,结合生理生化特征分析,结果表明：细菌HSBO1、HSB07分别属于葡萄球菌属(Staphylococcussp.)、盐单胞菌属(Halomonassp.);Genbank号分别为KC832320、KC832321。3)对2株溶藻细菌的菌落进行形态观察：细菌HSBO1呈浅黄色,菌落小而圆,表面凸起,粉质,边缘光滑；细菌HSB07透明,菌落较大而圆,湿润黏粘而不易被挑起,边缘不太光滑。电镜观察可知两株菌均无鞭毛。2.裸甲藻溶藻菌的抑藻特性1)在裸甲藻生长的第14天,即藻对数生长期末期,分别加入两株菌液,经差异显著性检验得出：加入HSB07菌液的藻培物一开始即与自然生长的藻培物藻密度存在显著差异,Sig值小于0.05；而加入HSBO1菌液的藻培物一开始与自然生长的藻培物藻密度差异不显著,Sig值为0.27>0.05,在接下来共培养期间,才表现出显著差异。这表明两株菌HSBO1、HSB07都能明显地抑制裸甲藻的生长。在藻对数生长期末期分别加入两菌培养液,都能加速藻由对数生长末期进入衰退期,且HSB07作用更明显。2)对细菌HSBO1、HSB07(?)抑藻特性进行研究,发现这两株菌的抑藻因子均不是细菌菌体,而是分泌的次级代谢产物,即间接抑藻。3.裸甲藻溶藻菌中活性物质的分离提纯1)通过对HSB07大量发酵、乙酸乙酯萃取粗提物进行抑藻试验表明：该粗提物具有较好抑藻活性。2)经过硅胶柱层析和薄层层析,得到两个组分B和C。3)将组分B和C分别与裸甲藻培养物共培养进行抑藻试验,发现组分B具有显著的抑藻作用,组分C亦具有一定的抑藻作用4)对组分B和C进一步进行凝胶柱层析、液相分析与分离,从组分C分离得到一个纯组分,即为组分#12。5)组分#12采用核磁共振和质谱分析鉴定,确定其分子量为414。具体结构还需进一步分析鉴定。6)通过正交实验发现：培养基pH8、盐度为3.5,发酵时间36h为相对最优发酵条件。在该条件下,细菌HSB07的胞外分泌物具有相对最强的抑藻活性。
【作者】刘娟；
【导师】刘兆普；刘玲；
【作者基本信息】南京农业大学，海洋生物学，2013，硕士
【关键词】溶藻细菌；裸甲藻；抑制效应；生物活性；

【参考文献】
[1]王琦宇.《杜诗阐》研究[D].西北大学,中国古代文学,2014,硕士.
[2]彭晓辉.海南苦丁茶提取物对2型糖尿病小鼠降血糖作用及其机制的研究[D].湖北中医药大学,药物化学,2013,硕士.
[3]张晓晨.我国国有商业银行脆弱性研究[D].南京大学,金融学,2013,硕士.
[4]刘庆伟.东北区域电力市场系统方案的设计与管理研究[D].大连理工大学,管理科学与工程,2003,硕士.
[5]张慧娟.洋葱状碳纳米颗粒/SnO_2复合锂离子电池负极材料的制备及性能[D].北京化工大学,2010.
[6]景华.基于和谐社会构建的基层政府公信力提升探析[D].西安建筑科技大学,行政管理,2013,硕士.
[7]毛琳.重庆市金融发展与经济发展关系研究[D].重庆工商大学,区域经济学,2014,硕士.
[8]任海坤.基于开放平台的移动互联网终端设计方案的研究与实现[D].山东大学,电子与通信工程（专业学位）,2012,硕士.
[9]乔国永.话语生成的理论基础及其对口语教学的启示[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[10]朱春华.多功能纳米复合水凝胶与石墨烯纳米复合材料的制备及性能研究[D].中国科学技术大学,2013.
[11]金太军,袁建军.政府与企业的交换模式及其演变规律——观察腐败深层机制的微观视角[J].中国社会科学,2011,01:102-118+222.
[12]刘晋.不认罪案件诉讼程序研究[D].中国社会科学院研究生院,司法制度（专业学位）,2014,硕士.
[13]伍云涛.中药生产中复合过滤分离集成工艺技术的研究[D].天津大学,化工过程机械,2004,硕士.
[14]张素智.美国高校科研管理特点及对我们的启示[J].郑州轻工业学院学报(社会科学版),2014,05:20-22.
[15]王满彪.基于Xen的进程恢复系统的设计与实现[D].湖南大学,计算机科学与技术,2011,硕士.
[16]周恒.几种咪唑类功能化离子液体的研究及应用[D].湘潭大学,2012.
[17]徐灵芝.雷竹笋渣膳食纤维的制备工艺及其物化特性研究[D].中南林业科技大学,农产品加工及贮藏工程,2014,硕士.
[18]张振.新型纳米复合材料在电化学传感器中的应用研究[D].上海大学,钢铁冶金,2014,博士.
[19]张志清.达尔文主义与苔丝悲剧的社会性[D].湖南师范大学,英语语言文学,2004,硕士.
[20]贾玲.历史时期西南地区温泉的分布、开发利用与温泉文化[D].西南大学,历史地理学,2014,硕士.
[21]高为炳.非线性大系统在有限域中的鲁棒稳定性[J].自动化学报,1986,03:221-228.
[22]贾战雨.共同饮酒人损害赔偿案的案例分析[D].兰州大学,民商法（专业学位）,2013,硕士.
[23]刘道玉.脱氮副球菌的好氧反硝化特性及在水体氮素转化中的作用研究[D].南京农业大学,水产养殖,2012,硕士.
[24]勉斌.基于linux的智能交通违章识别系统[D].西南交通大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[25]王洪求,杨午阳,谢春辉,郑多明,王海龙,张喜梅,蒋春玲.不同地震属性的方位各向异性分析及裂缝预测[J].石油地球物理勘探,2014,05:925-931+820-821.
[26]勾洪浩.机车粘着控制驱动动力学仿真研究[D].西南交通大学,车辆工程,2013,硕士.
[27]聂姗姗.牡丹江地区农村体育彩票发展问题研究[D].吉林大学,农业推广,2012,硕士.
[28]田东.银行决策系统中基于Web的OLAP构件[J].管理科学文摘,2005,03:44-45.
[29]文必龙,刘贤梅,郭立君,张剑光,苏斐.基于POSC平台的数据仓库[J].大庆石油学院学报,2002,01:57-60+116.
[30]白晓征.在叙事与考证之间[D].华中师范大学,文艺学,2014,硕士.
[31]金军伟.改良手法复位夹板固定治疗桡骨远端屈曲型骨折的临床观察[D].福建中医药大学,中医骨伤科学（专业学位）,2013,硕士.
[32]王青.高速公路不停车收费车道系统的设计与实现[D].大连海事大学,计算机技术,2012,硕士.
[33]宋庆奎,吴国军.高炉换风口机的设计与研制[J].一重技术.1998(03)
[34]童红霞.ICAI中知识点关系的研究及其应用[D].湘潭大学,计算机应用技术,2003,硕士.
[35]赵薇.基于B/S模式的红河学院国际教育家校平台的开发[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[36]杨燕.基于四维CT的食管癌靶区运动的初步研究[D].福建医科大学,肿瘤学（专业学位）,2014,硕士.
[37]刘明亮.云理论对粗糙集方法的改进[D].武汉大学,2004.
[38]陈明明.油田水处理中的变频电磁防垢技术研究[D].东北石油大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[39]吴伟.重庆某超高层塔楼结构方案优化研究[D].重庆大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[40]陈辉金,韩元杰.数据挖掘和信息融合在保险业欺诈识别中的应用[J].计算机与现代化,2005,09:110-112.
[41]黄凌.归因风格及情绪对购买决策影响的实验研究[D].华东师范大学,2007.
[42]刘思思.硅基超疏水微界面材料润湿特性和摩擦学性能研究[D].北京交通大学,2014.
[43]杨明勋.τ值采集电路改装成功[J].石油地球物理勘探,1987,02:155.
[44]肖世妙.福建省农业机械购置补贴政策研究[D].华侨大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[45]林升.厚板焊接接头残余应力和损伤分布的研究[D].北京交通大学,2013.
[46]孟婷.电能质量综合评估方法研究及系统开发[D].湖南大学,电气工程,2012,硕士.
[47]王学雷,邵惠鹤.一种基于改进双通道继电测试的闭环辨识方法研究[J].控制与决策,2002,04:411-414.
[48]朱世武,崔嵬,谢邦昌.移动电话客户流失数据挖掘[J].数理统计与管理,2005,01:62-68+44.
[49]杨洋.肉食动物细小病毒重组疫苗研究[D].吉林大学,预防兽医学,2013,硕士.
[50]丁敏.课堂教学中的师生冲突[D].华东师范大学,教育学原理,2001,硕士.